使用單細胞蛋白(bái)組技術進行免疫分(fēn)析——加速臨床前研發
免疫療法已被證明是一(yī)種很有前途的治療方法。但由于免疫相關的潛在的嚴重不良反應，使許多研究人員(yuán)依賴小(xiǎo)鼠模型來獲得對于研究的治療産品或療法進行更深入的了解。從早期研發到臨床的整個過程中(zhōng)，IsoPlexis的單細胞解決方案一(yī)直在這方面幫助研究人員(yuán)，通過體(tǐ)外(wài)實驗獲得與體(tǐ)内活性相關指标。
通過檢測每個細胞同時分(fēn)泌多個細胞因子的能力，即細胞的多功能性，檢測最有效的細胞亞群進而建立這種聯系。對于單細胞多功能檢測，允許研究人員(yuán)發現臨床前發展的新機制，并加速他們的研究。相比于傳統的動物(wù)模型實驗有着很大(dà)的優勢。
IsoPlexis單細胞蛋白(bái)組技術使用了一(yī)種綜合的評價标尺--細胞多功能指數(PSI)，對細胞的功能進行表征。PSI作爲單細胞功能生(shēng)物(wù)标志(zhì)物(wù)的新标準，可以幫助研究人員(yuán)加速他們的免疫治療項目。
這個新解決方案運行在IsoLight、IsoSpark和IsoSpark Duo系統上，與之配套的是通用的IsoCode芯片，一(yī)張芯片可分(fēn)離(lí)500-1500個單細胞，進行單細胞培養，檢測細胞的分(fēn)泌蛋白(bái)。獨特的條形碼技術可同時檢測一(yī)個細胞分(fēn)泌的的多達32個細胞因子。這使得研究人員(yuán)能夠深入研究細胞的功能。
多功能性GPC3 CAR-T治療小(xiǎo)鼠原位肝癌
Glypican3(GPC3) 是Wnt依賴性細胞增殖的抗原，在肝癌 (HCC)中(zhōng)高表達。2020年在Gastroenterology(IF = 22.682)文章中(zhōng)報道，研究者利用基于人源化YP7(hYP7)和HN3抗體(tǐ)制備CAR-T細胞，靶向GPC3，并評價其功能。
多功能T細胞是T細胞的一(yī)個亞群，能夠在單細胞水平上共同産生(shēng)兩個或多個細胞因子/趨化因子，最近有報道稱它們在臨床環境中(zhōng)與持久免疫反應相關。研究者使用IsoPlexis的單細胞蛋白(bái)組技術對制備的CAR-T進行了功能評價。使用能夠同時檢測32種關鍵的T細胞免疫因子的芯片對CAR-T細胞分(fēn)泌的細胞因子進行檢測，比較了CAR（HN3）T細胞或CAR(hYP7)T細胞的多功能性，與Mock對照組相比，CAR(hYP7)T細胞能夠分(fēn)泌多種因子的細胞比例更高，表現出更強的多功能性，提示可能有着更強的功能、更好的治療效果（圖1）。
圖1：Heatmap圖顯示hYP7 CAR-T細胞中(zhōng)表現出更強的多功能性。
在之後的小(xiǎo)鼠模型實驗中(zhōng)，研究者在NOD/SCID/IL-2Rgcnull(NSG)小(xiǎo)鼠腹腔注射表達熒光素酶的Hep3B或HepG2細胞，在腫瘤形成後，小(xiǎo)鼠注射生(shēng)理鹽水或未轉導的T細胞（Mock），或不同劑量的CAR（HN3）T細胞或CAR(HYP7) T細胞。結果顯示，在CAR（HN3）T細胞處理的小(xiǎo)鼠中(zhōng)沒有發現明顯的腫瘤生(shēng)長抑制。接受20 M CAR (hYP7) T細胞治療的小(xiǎo)鼠在第70天均存活，沒有複發。接受hYP7 CAR-T細胞注射的小(xiǎo)鼠的治療效果是更好的（圖2）。
圖2：對照與多種劑量不同CAR-T組效果對比
Li D, Li N, Zhang YF, Fu H, etc. Persistent Polyfunctional Chimeric Antigen Receptor T Cells That Target Glypican 3 Eliminate Orthotopic Hepatocellular Carcinomas in Mice.Gastroenterology.2020 Jun;158(8):2250-2265.e20.
基于APRIL三聚體(tǐ)（TriPRIL）設計的CAR-T細胞靶向治療多發性骨髓瘤
2019年Blood Advances雜(zá)志(zhì)上題爲《Rational Design of a Trimeric APRIL-Based CAR Binding Domain Enables Efficient Targeting of Multiple Myeloma》的文章中(zhōng)，研究者發表了基于APRIL三聚體(tǐ)的CAR結合域的合理設計靶向多發性骨髓瘤的研究進展。
在多發性骨髓瘤的治療和研究中(zhōng)，CAR-T細胞治療提供了新的治療路徑，其中(zhōng)靶向B細胞成熟抗原(BCMA)的CAR-T細胞治療是迄今爲止最有希望的治療方式，但其療效仍然存在挑戰，因爲在單特異性抗BCMA CAR-T細胞治療的選擇壓力下(xià)，會出現BCMA抗原逃逸變異，從而導緻疾病複發，因此仍需要不斷改進CAR-T細胞以改善多發性骨髓瘤的療效。
在這裏研究者證實了基于APRIL三聚體(tǐ)的新型CAR（圖3）能有效地靶向BCMA陽性和BCMA陰性的多發性骨髓瘤。雙特異性、基于三聚體(tǐ)APRIL 的CAR是一(yī)種很有前途的治療多發性骨髓瘤的方法，有可能預防和治療BCMA抗原逃逸。
圖3：APRIL和TriPRIL CARs設計
研究者将對照T細胞（UTD）、BCMA、APRIL和TriPRIL CAR-T同表達BCMA和TACI的靶細胞一(yī)起培養，靶細胞會刺激T細胞分(fēn)泌細胞因子，使用IsoPlexis檢測32種細胞分(fēn)泌蛋白(bái)的條形碼芯片捕獲T細胞表達細胞因子。相對于其它實驗組，TriPRIL CAR-T組細胞中(zhōng)的多功能細胞的比例顯著提高（圖4），單細胞分(fēn)析表明，CD4+和CD8+T細胞主要分(fēn)泌效應型細胞因子，在不同的CAR-T中(zhōng)細胞因子分(fēn)泌譜相似，但分(fēn)泌頻(pín)率有顯著差異（圖5）。
圖4：單細胞蛋白(bái)質組學檢測不同CAR-T的多功能細胞的比例
圖5：單細胞水平表征分(fēn)泌因子圖譜
動物(wù)實驗方面，在BCMA陽性小(xiǎo)鼠腫瘤模型中(zhōng)，BCAM和TriPRIL CAR-T的治療效果都是很好的；在BCMA陰性小(xiǎo)鼠腫瘤模型中(zhōng)，因爲腫瘤抗原逃逸，隻有TriPRIL CAR-T取得了很好的治療效果（圖6）。
圖6：小(xiǎo)鼠實驗結果，TriPRIL CAR-T有效靶向BAMA陽性和陰性的多發性骨髓瘤。
Schmidts A , Ormhj M , Choi B D , et al. Rational design of a trimeric APRIL-based CAR-binding domain enables efficient targeting of multiple myeloma - ScienceDirect[J]. Blood Advances, 2019.
總結
動物(wù)實驗動辄需要數個星期，甚至如第一(yī)個實驗，需要持續70天；單細胞蛋白(bái)組技術在一(yī)周内即可完成細胞功能的表征。應用于體(tǐ)内療效相關性分(fēn)析時，單細胞蛋白(bái)組技術體(tǐ)現了以下(xià)特點：
-其結果與動物(wù)實驗是可比的；
-可以很好的優化研究和藥物(wù)研發流程；
-夠加快體(tǐ)内實驗的進程，節省寶貴的時間；
-找到關鍵分(fēn)泌蛋白(bái)，指導後續研究。