如何加強CAR-T療效：單CAR雙CAR？二代三代……

衆所周知(zhī)，CAR-T結構包括三部分(fēn)：

（1）識别靶抗原的胞外(wài)scFv區；

（2）跨膜鉸鏈區；

（3）胞内信号結構域，以介導T細胞信号轉導，引起T細胞活化、擴增和抗腫瘤免疫應答等。

CAR-T細胞療法的發展。（圖片來自Journal of Controlled Release, 2020, 319:246-261.）

其中(zhōng)胞外(wài)區結構決定了CAR的特異性和與靶抗原的結合親和力。随着CAR-T的發展，逐漸發現單靶點CAR-T細胞療效受限于腫瘤抗原的異質性，常出現腫瘤複發的問題，于是近年來逐漸向多靶點CAR-T細胞療法轉變，比如探索CD19/CD20雙特異性CAR治療複發難治性B細胞淋巴瘤等。

另外(wài)，胞内結構域近年來也做了不斷優化。從二代CAR開(kāi)始，就加入了不同的共刺激信号結構域，以解決一(yī)代CAR在體(tǐ)内存活時間較短，且活性差的問題。二代CAR-T技術依據不同的共刺激結構域主要分(fēn)爲兩大(dà)類：基于CD28和基于CD137（4-1BB）的共刺激結構域。一(yī)般認爲，CD28所傳遞的活化信号相較于CD137（4-1BB）更強，可使T細胞在較短時間内達到很高的殺傷活性。而CD137（4-1BB）所傳遞的活化信号則會更加持久。

到三代CAR-T同時引入兩個共刺激信号分(fēn)子，以期提高T細胞增殖活性、細胞毒性，并延長T細胞存活時間。第四代CAR-T結構引入了自殺基因、促炎症細胞因子和共刺激配體(tǐ)等，希望達到精細調控和克服腫瘤免疫微環境抑制等目的。

墨菲特癌症治療及研究中(zhōng)心（H.Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute）Marco L Davila博士帶領的研究團隊新近在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（影響因子 13.751）發表題爲“4-1BB and optimized CD28 co-stimulation enhances function of human mono-specific and bi-specific third-generation CAR T cells “的研究文章表明，4-1BB和經過優化的CD28共刺激信号可增強三代單特異性CAR和雙特異性CAR的功效，包括細胞擴增、細胞持久性和抗耗竭能力等。

作者設計了4-1BB或聯合僅含有PYAP信号基序（mut06）的CD28作爲CD19特異性CAR-T細胞的共刺激信号，通過細胞和分(fēn)子生(shēng)物(wù)學體(tǐ)外(wài)和體(tǐ)内實驗對不同設計結構的CAR-T細胞進行評估，包括：

1、 體(tǐ)外(wài)細胞分(fēn)析：免疫表型、細胞因子分(fēn)泌、實時細胞毒殺傷能力和CAR-T多功能性反應

2、體(tǐ)外(wài)蛋白(bái)定量：Western blot分(fēn)析不同CAR-T的LCK募集情況

3、小(xiǎo)鼠體(tǐ)内腫瘤模型實驗：在NOD scid γ (NSG)小(xiǎo)鼠模型中(zhōng)分(fēn)析CAR-T對Raji細胞腫瘤的控制

此外(wài)，作者還結合4-1BB和mut06設計了雙特異性CD20/CD19 CAR，并采取以下(xià)實驗進行評估：

1、多次體(tǐ)外(wài)抗原刺激：分(fēn)析細胞擴增能力、細胞記憶性表型、PD1+CD39+表型（細胞耗竭）

2、小(xiǎo)鼠腫瘤模型：在Raji或Nalm6小(xiǎo)鼠腫瘤模型中(zhōng)研究雙特異性CAR-T細胞清除CD20/CD19腫瘤細胞的能力。

所有CAR結構包括FMC63 scFv胞外(wài)區和CD8α跨膜鉸鏈結構域，不同之處在于胞内的共刺激信号。

wh1906z (mut06)：與CD28子結構域相比，h1906z用FMNM和ARRA取代了YMNM和PRRP，隻留下(xià)一(yī)個功能性的PYAP信号基序。

wh1906BBz：在細胞膜近端是mut06結構域，然後依次是4-1BB和CD3ζ。

wh19BB06z：在細胞膜近端是4-1BB結構域，然後依次是mut06和CD3ζ。

将不同設計的CAR-T細胞與靶細胞（3T3-hCD19）以1:10的效靶比共培養24小(xiǎo)時，流式檢測CAR-T細胞表型，結果顯示：

1、 h19BB06z細胞表面的CAR表達水平最高，與靶細胞刺激前趨勢一(yī)緻。

2、 在與靶細胞共培養後，同時含有4-1BB和mut06共刺激信号的CAR-T（h1906BBz和h19BB06z）具有更高的CD4/CD8比例，同樣與靶細胞共培養前的趨勢一(yī)緻。

3、在與靶細胞共培養後，同時含有4-1BB和mut06共刺激信号的CAR-T（h1906BBz和h19BB06z）細胞含有更高比例的中(zhōng)央記憶性T細胞（CCR7+CD45RA-）。

爲了進一(yī)步驗證在更長時間點的細胞分(fēn)化情況，研究人員(yuán)每周用靶細胞刺激CAR–T，共計3周。結果顯示h19BB06z CAR-T細胞能夠保持更持久的高比例中(zhōng)央記憶性細胞表型，而其餘的CAR-T偏向T細胞分(fēn)化表型。

綜上，與其他CAR-T結構相比，h19BB06z CAR-T細胞可以保持更持久、更高水平的中(zhōng)央記憶性細胞表型。

二、4-1BB和mut06共刺激結構域影響h1906BBz和h19BB06z CAR-T細胞的功能

對CAR-T細胞的功能檢測包括細胞因子定量、細胞多功能性檢測、體(tǐ)外(wài)殺傷實驗和胞内信号轉導分(fēn)析。

1、細胞因子檢測

爲了檢查不同CAR的效應功能，研究人員(yuán)将三名健康人來源的CAR-T細胞與靶細胞以1:10的效靶比共培養24小(xiǎo)時，收集上清檢測細胞因子含量。

結果顯示：

wh1906z (mut06)的IFN-γ、IL-2和TNFα水平最低，與CD28結構突變導緻的信号傳導抑制和功能受損有關。

w當4-1BB與mut06共刺激信号聯合時，細胞上清中(zhōng)IFN-γ、IL-2和TNF-α的分(fēn)泌增加，尤其是h19BB06z。

wIL-6的分(fēn)泌與患者的CRS相關，在所有CAR結構中(zhōng)均保持較低水平，除了h19BB06z。

2、細胞多功能性檢測

此外(wài)，研究人員(yuán)還探索了CAR-T細胞的多功能性，即單個細胞分(fēn)泌兩種及以上細胞因子的能力。已有多項研究表明，CAR-T細胞的多功能性是體(tǐ)内生(shēng)理效應的一(yī)個重要預測指标。爲了驗證這一(yī)點，作者采用微流控芯片，在單細胞水平上分(fēn)析了數百個CAR-T細胞分(fēn)泌的28種細胞因子，包括分(fēn)泌頻(pín)率和細胞因子強度。

将CAR-T細胞與靶細胞共培養4小(xiǎo)時後加載到芯片進行分(fēn)析，結果發現h1928z、h1906BBz和h19BB06z的多功能細胞百分(fēn)比增加。細胞多功能指數（PSI）是衡量CAR-T細胞療效的預測性指标，通過計算多功能細胞的百分(fēn)比乘以所分(fēn)泌的各種細胞因子的強度獲得。采用這一(yī)檢測方法顯示，h1928z、h1906BBz和h19BB06z具有最高的PSI水平。這些數據說明4-1BB和mut06結合可以增強CAR-T細胞的多功能性，與h1928z相當。

3、體(tǐ)外(wài)殺傷能力檢測

所有CAR-T在兩種效靶比下(xià)（5:1和1:1）都具有快速有效的殺傷作用。這表明體(tǐ)外(wài)細胞毒作用不受共刺激域的選擇或組合的影響。

4、CAR-T細胞胞内信号轉導分(fēn)析

淋巴細胞特異性蛋白(bái)酪氨酸激酶（LCK）是影響CAR-T細胞功能的關鍵信号轉導分(fēn)子。最近有研究表明，LCK募集到4-1BB CARs可以增強CAR-T細胞的細胞毒性。研究人員(yuán)對不同CAR在靶細胞刺激24h後的胞内LCK磷酸化水平進行了分(fēn)析，發現與第二代CARs相比，第三代CARs的pLCK均有所增加。

而且，h19BB06z的LCK磷酸化水平最高，說明共刺激域的位置可能會影響pLCK。此外(wài)還發現大(dà)量的pLCK和總LCK與h19BB06z CAR分(fēn)子相關。這些數據表明，h1906BBz和h19BB06z的體(tǐ)外(wài)功能增強是由于pLCK的增加，共刺激區域的定位可影響CAR相關的LCK信号。

三、共刺激域定位影響細胞體(tǐ)外(wài)擴增和體(tǐ)内腫瘤殺傷

1、CAR-T體(tǐ)外(wài)持續擴增能力

靶比的靶細胞刺激CAR-T細胞，每7天重複刺激一(yī)次，共計4周，檢測CAR-T細胞反應性。

結果顯示在重複抗原刺激後，h19BB06z CAR - T細胞表現出最強的體(tǐ)外(wài)擴增能力、細胞毒作用和細胞因子分(fēn)泌。

而h1906BBz CAR-T細胞比h19BB06z表現出更低的增殖、細胞毒作用和IL-2的産生(shēng)，再次表明共刺激域定位可以影響CAR功能。

2、體(tǐ)内抗腫瘤能力

爲了确定h1906BBz和h19BB06z CAR-T細胞在體(tǐ)内控制腫瘤生(shēng)長的能力，研究人員(yuán)将Raji B淋巴細胞腫瘤細胞注射到NSG小(xiǎo)鼠體(tǐ)内形成腫瘤。結果發現，與UT和h1906BBz相比，h19BB06z CAR-T細胞能夠更好地控制腫瘤生(shēng)長。在接受h19BB06z治療的小(xiǎo)鼠血液中(zhōng)，CAR+細胞略有增加，CD19+細胞相應減少。

總之，這些數據表明，與h1906BBz相比，h19BB06z CAR-T細胞在體(tǐ)外(wài)增殖、長期細胞毒性和體(tǐ)内腫瘤殺傷能力增強。因此，研究人員(yuán)選擇BB06方向進行進一(yī)步的評估。

四、雙特異性CAR-T研究

後續，研究人員(yuán)開(kāi)發了四種能夠識别人CD19和CD20抗原的雙特異性CAR（結構設計如下(xià)），這種多抗原識别方法在以往研究中(zhōng)發現可以減緩由于腫瘤抗原逃逸引起的疾病複發。而且，這四種CAR-T包含二代或三代CAR結構，以進行深入比較。

在後續研究中(zhōng)，作者依然采用了前文所述的不同研究方法對各種雙特異性CAR-T進行評估和比較，包括細胞表型、細胞因子分(fēn)泌、細胞擴增和體(tǐ)外(wài)/體(tǐ)内腫瘤殺傷能力等。

當然，除了常規細胞評估方法外(wài)，作者還采用了IsoPlexis單細胞功能蛋白(bái)組技術來評估細胞多功能性和PSI（細胞多功能指數）哦~

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